近期在質(zhì)粒構(gòu)建是PCR和酶切后都有目的條帶，但是就是連接轉(zhuǎn)化后沒有點(diǎn)，或者有點(diǎn)但是是陰性的，哪有問(wèn)題

以前遇到過(guò)類似問(wèn)題，當(dāng)時(shí)主要問(wèn)題是酶切用的內(nèi)切酶不太好了。后來(lái)我們改進(jìn)了方法，先把PCR產(chǎn)物連到T simple載體上（這很容易），測(cè)序無(wú)誤后再將它們從T載體上切下來(lái)，這樣可以保證你看到的條帶全部是已經(jīng)切好的。然后進(jìn)行連接。

連T載體拿去測(cè)序 看P出來(lái)的是不是你要的條帶 要么就是質(zhì)粒酶切的之后回收的不好 最好在旁邊跑一道沒有切的質(zhì)粒 這樣能看出來(lái)哪條帶是切開的質(zhì)粒

都有可能
你可以多做幾個(gè)對(duì)照,如空載體轉(zhuǎn)化、空細(xì)胞涂板等等，幫助縮問(wèn)題小范圍
你可以詢問(wèn)實(shí)驗(yàn)室其他人員，看看酶是否有問(wèn)題，感受態(tài)是否有問(wèn)題，抗生素是否有問(wèn)題，等等
按你給的線索，菌落很少，很有可能是切開的線性質(zhì)粒沒有連上片段，轉(zhuǎn)不進(jìn)細(xì)胞，少量沒有切開的空載體轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，形成陰性菌落。問(wèn)題可能在片段酶切上，建議連T載體再切，或雙酶切換成兩步單酶切，或換酶切位點(diǎn)，或重新設(shè)計(jì)保護(hù)堿基