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構建載體的時候，先用設計好的引物PCR所要的目的基因，再和T載體連接，再轉化，再小抽，再雙酶切，再和

2022-09-23 04:51

已經預先雙酶切的目的載體連接，那么？先前的目的基因為什么不直接和目的載體相連呢？為什么還要經過T載體這一步呢？（所用引物未使用保護堿基），是什么原因呢？

1個回答

理論上講PCR產物可以直接酶切連接反應。
但是，以PCR產物酶切的時候沒有辦法證明雙酶切是否成功、徹底（PCR產物會有ployA的存在必須切掉，但是PCR產物和酶切產物大小差別不大）。而以T載體為媒介，雙酶切T載體，跑膠檢測可以很清楚的看到酶切產物，并特異回收。

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1個回答2022-10-27 20:41

可能是質粒在轉菌后部分堿基出現(xiàn)錯配或者突變導致你酶切的位置發(fā)生變化.因為你pcr擴增只是你引物的位置只要不突變就可以正常擴增.建議你做個測序.

1個回答2022-12-24 12:18

不用的，因為你PCR的時候加的 Tag酶，在擴增過程中它會在末端加上A... T vector就會與A結合了你可以在下一步步驟中，選擇酶切位點去剪切后再與你的目的載體連接。

4個回答2022-11-28 12:12

我們用天根公司的膠回收試劑盒，回收目的基因及載體雙酶切后的產物用于連接，連接體系如下：一般載體1微升，目的基因8微升左右（沒.測OD）,用T4DNA連接酶（購于TaKaRa公司）1微升，再加酶緩沖液（...

2個回答2022-12-24 07:05

不可以，高保真酶產物一般都是平末端。純化產物加taq酶，buffer和dNTP，72℃反應10~30分鐘即可加尾，產物就可以直接與 T載體連接了。

1個回答2023-05-17 02:57

T載體是一種克隆載體，鏈接后先得到較多的拷貝，可以提高鏈接表達載體的效率。

1個回答2022-12-16 10:24

普通的taq聚合酶會在PCR反應過程中在3’末端加入一個堿基A，線性化平末端T載體的兩端分別又人工加上一個額外的T堿基，從而可與PCR克隆產物的A末端互補配對，提高了PCR產物連接和克隆的效率。

4個回答2022-09-15 11:28

設計引物，引物兩端帶有設計好的酶切位點，找個有目的基因的細胞，提了ran，然后把目的片段p出來，然后跑膠，試劑盒回收目的片段。把載體和目的片段用同樣的雙酶切，再跑膠，回收切開的載體和目的片段，連接吧。

2個回答2023-04-19 00:10

要構建重組載體的目的就是把目的基因連到載體上，所以最有效的重組dna是目的基因-載體。目的基因-目的基因和載體-載體都是失敗的結果，這種結果的產生相對導致基因-載體的結果產生率下降。一般做重組載體選...

1個回答2023-04-21 00:10

那要看你用什么方式構載體。如果用酶切連接的方式，可以直接酶切。如果用同源重組，應該是要PCR的

1個回答2023-04-14 05:02

前一段時間我也是，不知道為毛，T-A克隆就是不成功。。。以前的以前輕松的事情，前段時間就是塞不進去。后來，我試了平末端克隆，反而長菌了。。菌落數(shù)比較少，但是陽性率還行。由于平末端克隆試劑盒一般小貴，...

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